Allgemeine Informationen

Hintergrund

Der HPLC-Pool öffnete im November 2009 seine Türen. Durch die Bündelung von bestehenden HPLC-Systemen sollte eine bessere Versorgung der einzelnen Arbeitsgruppen der Fachgruppe Chemie im Bereich Flüssigkeitschromatographie erreicht werden. Die Betreuung und Wartung obliegt einem technischen Mitarbeiter, dessen Aufgabengebiet (neben Beschaffung, Wartung und Pflege der Geräte) die Methodenentwicklung und Durchführung analytischer und (semi-)präparativer HPLC-Trennungen beinhaltet.

Methoden

Für Trennungen im HPLC-Pool eignen sich vorgereinigte Substanzgemische, die sich in organischen und / oder wässrigen Eluenten lösen müssen. Von der Löslichkeit (also der Polarität des Trenngemisches) hängt die Wahl der Trennmethode ab. Im HPLC-Pool können folgende Trennmethoden angewendet werden:

Normalphasen-Trennungen 
Darunter versteht man die Trennung über eine polare stationäre Phase wie z. B. Kieselgel (SiOH) auf der unpolare Substanzen schneller eluiert werden als polare. Für bestimmte Anwendungen wird herkömmliches Kieselgel chemisch modifiziert, indem die OH-Gruppen durch andere Reste ersetzt werden. Dies hat eine Veränderung der Polarität und eine differenzierte Selektivität zur Folge. Beispiele für chemisch gebundene Phasen, die im HPLC-Pool vorhanden sind, sind Nitril-(CN), oder Amino (NH2). Bei Normalphasen-Trennungen bestehen die Eluenten meist aus Alkanen (wie n-Hexan oder n-Heptan) und tert.-Butylmethylether (t-BME). Andere Lösungsmittel wie Dichlormethan, Essigsäureethylester, Tetrahydrofuran, Aceton können in Hinblick auf ihre UV-Durchlässigkeit z.T. nur bedingt verwendet werden. 

Reversed-Phase-Trennungen
Reversed-Phase-Trennungen finden - wie der Name bereits andeutet - auf Umkehrphasen statt. Hierbei handelt es sich ebenfalls um chemisch modifizierte Kieselgel-Phasen, bei denen die OH-Gruppen durch extrem unpolare Reste ersetzt worden sind. Das klassische Beispiel sind Alkanketten von unterschiedlicher Länge (meist C 8- oder C 18-Ketten) oder aromatische Reste wie Propylphenyl. Reversed-Phasen-Säulen sind also im Unterschied zu unmodifiziertem Kieselgel extrem unpolar, was bedeutet, dass polare Verbindungen schneller eluiert werden als unpolare. Gängige Laufmittelgemische sind Wasser-Methanol oder Wasser-Acetonitril; auch Puffer sind möglich, da Reversed-Phase-Methoden durch die Veränderung des pH-Wertes optimiert werden können. Bedingt durch die kurzen Equilibrierungszeiten der stationären RP-Säulen sind hier auch Fließmittelgradienten möglich, da die Phasen weniger stark mit dem Laufmittel in Wechselwirkung treten als bei herkömmlichen Kieselgelen und die Eluenten meist eine hohe UV-Durchlässigkeit besitzen.

UHPLC
Unter UHPLC versteht man eine Steigerung der klassischen HPLC-Methodik. Hier werden besonders feinkörnige Säulenmaterialen (1,8 - 2 µm) verwendet, wo durch eine extrem hohe Auflösung erreicht wird. Die Trennsäulen haben darüber hinaus einen kleinen Durchmesser und sind in der Regel 50 mm oder 100 mm lang. UHPLC-Säulen können mit einem weiten Flussbereich und sehr hohem Gegendruck (bis 1000 bar) betrieben werden und können so einen Verkürzung der Analysenzeit um den Faktor 10 erreichen. Neben der Zeitersparnis reduziert sich auch der Verbrauch hochreiner Lösungsmittel - und somit auch der anfallende Abfall. Die UHPLC wird  überwiegend für Reversed-Phase-Trennungen, Kalibrierungen und für chirale Methoden verwendet.

Chirale Trennungen
Unter chiralen Trennungen versteht man die Aufspaltung von optisch aktiven Substanzgemischen, wie z.B. Racematen und anderer Strukturisomeren. Die Seperation erfolgt auf speziellen Säulenmaterialen, die meist aus Cellulose- oder Amylosecarbamaten bestehen, die auf Kieselgel aufgezogen sind. Diese Säulen sind sehr empfindlich und können nur mit bestimmten Laufmitteln (i.d.R. Alkan-Alkohol-Mischungen) betrieben werden. Alternativ stehen einige chirale Phasen zur Verfügung, bei denen der chirale Selektor kovalent an das Kieselgel gebunden ist. Diese von der Fa. Daicel Industries Ldt., Japan entwickelten immobilisierten chiralen Trennphasen dürfen mit allen gängigen organischen Lösungsmitteln betrieben werden - und können je nach Eluent eine andere Selektivität aufweisen. Alle  Phasen erlauben auch die Verwendung im Reversed-Phase-Modus. Chirale Trennmethoden müssen mit einem racemischen Gemisch entwickelt und optimiert werden.

(Semi) Präparative Aufreinigungen (NP,- RP-; und chirale Trennungen)
Auf Wunsch sind neben analytischen Trennungen auch semi-präparative Aufreinigungen möglich - sofern die entsprechende Säule vorhanden ist und vorher eine erfolgreiche analytische Methode entwickelt werden konnte. Hierzu stehen ein semi-präparatives (bis 50 ml/min; 200 bar (bis 10 ml/min; 300 bar (ab 10 ml/min)) und zwei präparative Trennsysteme (bis 100 ml/min; 400 bar) zur Verfügung. Je nach Menge des zu trennenden Substanzgemisches stehen Säulen mit einem Durchmesser von 8 mm, 16 mm und 20/21 mm zur Auswahl. Ferner ist es möglich, für schwer trennbare Fraktionen ein Peakrecycling durchzuführen. D.h., dass die angetrennten Fraktionen mit Hilfe einer Ventilschaltung erneut auf die Säule aufgetragen werden können. Dieser Vorgang läßt sich auch mehrmals wiederholen, bis der gewünschte Trennungsgrad erreicht ist. Die Auftragmenge pro Trennungslauf hängt vom Trennproblem, der Löslichkeit der Probe und dem Durchmesser der Säule ab!

Quantitative Analyse (Kalibrierung mit Externem / Internem Standard)
Mit Hilfe von Kalibrierungen lassen sich Substanzmengen quantitativ (und mit hoher Empfindlichkeit) bestimmen. Hierzu wird eine Stammlösung des gesuchten Stoffes hergestellt und daraus unterschiedliche Verdünnungsproben mit bekannter Konzentration (meist in µg / ml) angesetzt. Diese Kalibrierungsproben (oder auch Eichlevels) werden gemessen, dabei die Fläche des gewünschten Produktpeaks mit Hilfe der Software integriert und aus den einzelnen Werten eine Eichkurve errechnet wird. (Kalibrierung mit Externem Standard). Anhand dieser Eichkurve kann dann die Konzentration der gesuchten Substanz in einer Probe bestimmt werden. Je mehr Eichlevels für den gesuchten Konzentrationsbereich verwendet werden, desto genauer ist das Resultat. Die Kalibrierung wird mit der Messmethode abgespeichert und kann immer wieder verwendet werden. Eine Nachkalibrierung ist ebenso möglich wie die Kalibrierung mehrerer Substanzen im gleichen Chromatogramm. Kalibrierungen können auch mit Hilfe eines Internen Standards durchgeführt werden. Dazu muss die Substanz, die den Proben als interner Standard zugesetzt wird, chemisch, physikalisch und chromatographisch ähnliche Eigenschaften wie das gesuchte Produkt aufweisen.

Detektion

UV/Vis-Detektion mit Photodiodenarray- und Multiwellenlängendetektoren
Die meisten organisch-chemischen Verbindungen weisen durch chromophore Gruppen in ihren Strukturen spezifische Absorbtionen im UV-Bereich des Lichtspektrums auf. Diese Absorbtionen werden für die Detektion in der HPLC am häufigsten verwendet. Alle analytischen Systeme im HPLC-Pool arbeiten mit Photodiodenarray-Detektoren (PDA), bei denen das komplette Lichtspektrum (UV und/oder Vis) durch die Meßzelle auf eine im Abstand von 1 nm angebrachte Reihe von Photodioden trifft. Das erzielt eine hohe Empfindlichkeit und erlaubt die Aufnahme von UV/Vis-Spektren der detektieren Peaks, was (neben der Retentionszeit) zusätzlich zur Identifizierung beitragen kann. Die präparativen Anlagen arbeiten mit Multiwellenlängendetektoren: hier kann man eine oder mehrere Messwellenlängen, je nach Bedarf und Komplexität des Trenngemisches, einstellen.

Detektion von Substanzen ohne chromophore Gruppen ("UV inaktiv")
Für die Detektion von Substanzen ohne chromophore Gruppen stehen im HPLC-Pool ein analytischer und ein präparativer Ri-Detektor (Ri = Refractive index / Brechungsindex) zur Verfügung. Wie bei einem herkömmlichen Refraktometer wird die Abweichung des Brechungsindexes des Eluenten mit Hilfe einer Vergleichsmesszelle ermittelt. Dadurch sind Trennmethoden mit Fließmittelgradienten nicht möglich. Auch ist die Empfindlichkeit deutlich geringer als mit herkömmlicher UV/Vis-Detektion.

LC / MS
LC / MS-Messungen werden in der Abteilung Massenspektroskopie in der Zentralanalytik der Chemischen Institute durchgeführt. Für Details wenden Sie sich bitte an Frau PD Dr. Marianne Engeser (Telefon: +49 (0) 228 73-2656).

LC / NMR
LC / NMR-Messungen werden in Zusammenarbeit mit der Abteilung NMR-Spektroskopie an einem AV III HD Cryo 700 MHz - Spektrometer der Firma Bruker in der Zentralanalytik der Chemischen Institute durchgeführt. Für genauere Informationen wenden Sie sich bitte an Frau Dr. Senada Nozinovic (Telefon: +49 (0) 228 73-2658).

Proben & Messungen

Proben werden vom Hersteller in ein kleines Präparategläschen abgewogen (i.d.R. ca. 1 bis 2 mg, bei UV-inaktiven Proben 10 bis 20 mg), beschriftet und nach vorheriger Absprache zur Messung im HPLC-Pool abgegeben. Zusätzlich ist der Probe ein entsprechender Auftragszettel ausgefüllt beizulegen. Substanzgemische für präp. Aufreinigungen sollten in kleinen Spitzkolben (5 oder 10 ml) einrotiert und genau ausgewogen werden.

BITTE BEACHTEN: Es ist aufgrund der Datei-Struktur im HPLC-Pool unerlässlich, auf den Auftragszetteln die interne Abteilungskennziffer (z.B. ME-015, GA-019 etc.) anzugeben! Sollte diese Nummer unbekannt sein, kann sie im Geschäftszimmer (OC Raum 0.103) bei Frau Isabel Scholz (Telefon: +49 (0) 228 73-5785) erfragt werden.

Der HPLC-Pool befindet sich im Raum 5.067 / 5.068 im 5. Stock des Kekulé-Instituts für Organische Chemie und Biochemie im Labortrakt OC-SW-Lehre, im Flur zum Dauerbetriebsraum. Eingang nach der Flurglastüre erste Tür rechts.

Geräte & Säulen

Eine genaue Vorstellung der einzelnen HPLC-Systeme finden Sie hier, für Details über die Trennsäulen klicken Sie bitte hier. Eine tabellarische Übersicht der Geräte und Säulen als PDF-Datei zum Download ist hier abgelegt.

Ergebnisse

Optimierte Trennergebnisse werden als Chromatogramm zusammen mit einem Messprotokoll als PDF-Datei per eMail an die Aufraggeber zugestellt. Zusätzlich ist es möglich, die Chromatogramme als ASCII-File zu exportieren. Bei präparativen Trennungen werden die Fraktionen in vom Auftraggeber bereitgestellten Rundkolben aufgesammelt (bitte passende, saubere (!) Glasschliffstopfen und Korkringe zum Abstellen der Kolben beifügen!).